李兆申,何小平,屠振兴,高 军,潘 雪,龚燕芳,金 晶
中国医学科学院学报. 2005, 27(5): 587-591.
摘要:目的 克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白。方法 从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatin cDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列。酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b(+),转化E. coli BL21,诱导表达重组蛋白。结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致。RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coli DH 5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致。将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b(+),转化E. coli BL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆。IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白条带。结论 成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。